बैक्टीरिया के ग्राम धुंधला प्रदर्शन के लिए प्रयोग (चित्रा के साथ)
यह जानने के लिए कि यह ग्राम-पॉजिटिव है या ग्राम-नेगेटिव है, बैक्टीरिया के ग्राम धुंधला करने के प्रयोग के बारे में जानने के लिए इस लेख को पढ़ें!
उद्देश्य:
माइक्रोबायोलॉजी में प्रयुक्त सबसे महत्वपूर्ण अंतर धुंधला धुंधला है।
इसका नाम डॉ। क्रिश्चियन ग्राम के नाम पर रखा गया है, जिन्होंने जीवाणुओं को वर्गीकृत किया, जो उनकी कोशिका भित्ति की संरचना में अंतर के आधार पर दो समूहों में निम्नानुसार हैं:
(1) ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया:
क्रिस्टल वायलेट के साथ एक बैक्टीरिया को दागने के बाद, अगर इसकी सेल की दीवार एक डीकोलाइजिंग एजेंट (इथेनॉल या एसीटोन) के साथ धोने से विघटित हो जाती है, तो यह एक ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया है। उदाहरण: बेसिलस, स्टैफिलोकोकस।
(२) ग्राम-नकारात्मक जीवाणु:
क्रिस्टल वायलेट के साथ एक बैक्टीरिया को धुंधला करने के बाद, अगर इसकी कोशिका भित्ति एक डीकोलाइजिंग एजेंट (इथेनॉल या एसीटोन) के साथ धोने से विघटित होने की अनुमति देती है, तो यह एक ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया है। उदाहरण: एस्चेरिचिया, साल्मोनेला, विब्रियो।
ग्राम पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव समूहों में बैक्टीरिया का विभेदन अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान के लिए उचित दिशा में आगे बढ़ने के लिए सबसे महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करता है। यह ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव समूहों में बैक्टीरिया के सरल विभेदन के लिए भी उपयोगी है। यह बैक्टीरिया कोशिकाओं के आकार और व्यवस्था के बारे में भी विचार देता है।
सिद्धांत:
चना धुंधला में, बैक्टीरिया की कोशिकाओं को पहले एक प्राथमिक दाग, क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग दिया जाता है जो कोशिकाओं में प्रवेश करता है और उन्हें बैंगनी-नीला दाग देता है। फिर, कोशिकाओं का एक मोर्डेंट, ग्राम आयोडीन के साथ इलाज किया जाता है, जो कोशिकाओं में प्रवेश करता है और एक अघुलनशील डाई-मॉर्डेंट कॉम्प्लेक्स (क्रिस्टल वायलेट-आयोडीन कॉम्प्लेक्स) बनाने वाले प्राथमिक दाग से बांधता है, जिससे दाग का बचना मुश्किल हो जाता है।
तब, कोशिकाओं को एक इथेनॉल या एसीटोन जैसे डिकोलराइजिंग एजेंट के साथ इलाज किया जाता है। यह लिपिड विलायक के रूप में और प्रोटीन निर्जलीकरण एजेंट के रूप में कार्य करता है। ग्राम पॉजिटिव कोशिकाओं में, डिकॉलेराइजिंग एजेंट शुरू में लिपिड विलायक के रूप में कार्य करता है, सेल की दीवार में मौजूद लिपिड की थोड़ी मात्रा को भंग कर देता है, जिससे इसमें मिनट छिद्र होते हैं। इसके बाद, यह कोशिका की दीवार प्रोटीन (पेप्टाइड्स) को निर्जलित करता है, जो छिद्रों को बंद कर देता है।
अब, दाग-धब्बेदार परिसर को डिकोलराइजिंग एजेंट द्वारा हटाया जाना मुश्किल है और कोशिकाएं प्राथमिक दाग के बैंगनी-नीले रंग को बरकरार रखती हैं। जब गुलाबी-लाल रंग के दाग, सफ़ारीन द्वारा जवाबी हमला किया जाता है, तो यह कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता है, क्योंकि छिद्र बंद हो गए हैं।
कोशिकाएँ प्राथमिक दाग के बैंगनी-नीले रंग को बनाए रखती हैं। दूसरी ओर, ग्राम-नेगेटिव सेल की दीवार में बड़ी मात्रा में लिपिड (एलपीएस) होता है, जो कि डीकोलाइजिंग एजेंट द्वारा भंग कर दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप बड़े छिद्र होते हैं। ये छिद्र कोशिका भित्ति प्रोटीन के निर्जलीकरण पर प्रशंसात्मक रूप से बंद नहीं होते हैं।
इसीलिए; दाग-मोर्डेंट कॉम्प्लेक्स छिद्रों के माध्यम से बच जाता है, जब डिकोलराइजिंग एजेंट द्वारा धोया जाता है और कोशिकाएं बेरंग दिखाई देती हैं। जब सफ़ारीन द्वारा जवाबी दाग लगाया जाता है, तो यह छिद्रों के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करता है और अंत में कोशिकाएँ प्रति-दाग का गुलाबी-लाल रंग लेती हैं।
सामग्री की आवश्यकता:
स्लाइड, लूप, प्राथमिक दाग (क्रिस्टल वायलेट), मोर्डेंट (ग्राम का आयोडीन), डिकोलराइजिंग एजेंट (95% इथेनॉल), काउंटर-स्टेन (सफारी), बैक्टीरिया, माइक्रोस्कोप, विसर्जन तेल का शोरबा / तिरछा / प्लेट कल्चर।
प्रक्रिया:
1. नल के पानी के नीचे एक स्लाइड को अच्छी तरह से साफ किया जाता है, जैसे कि पानी इसकी सतह पर बूंदों के रूप में नहीं रहता (चित्र 5.11)।
2. पालन करने वाले पानी को बिबुलस पेपर से मिटा दिया जाता है और स्लाइड को हवा में सुखाया जाता है।
3. बैक्टीरिया का एक स्मीयर स्लाइड के केंद्र में दो तरीकों से तैयार किया जाता है।
(ए) अगर अग्र प्लेट या अगर तिरछी तरफ उगने वाले जीवाणु का अवलोकन किया जाए, तो पानी की एक बूंद स्लाइड के केंद्र में डाल दी जाती है और प्लेट से बैक्टीरिया का एक लूप या तिरछा लौ पर बंधी लूप द्वारा इसे स्थानांतरित कर दिया जाता है। फिर, ड्रॉप में लूप के धीमे रोटेशन द्वारा, एक बैक्टीरिया निलंबन बनाया जाता है और यह तब तक फैलता है जब तक कि एक धब्बा प्राप्त नहीं हो जाता।
(ख) यदि तरल शोरबा में विकसित एक जीवाणु को देखा जाना है, बैक्टीरिया निलंबन की एक बूंद को सीधे लौ-निष्फल लूप द्वारा स्लाइड के केंद्र में रखा जाता है और एक स्मीयर फैलाकर बनाया जाता है।
4. स्मीयर हवा से सुखाया जाता है।
5. स्मीयर को गर्म करके तय किया जाता है। सेल्युलर प्रोटीन के जमाव के कारण हीटिंग का परिणाम होता है, जिसके कारण कोशिकाएँ स्लाइड की सतह से चिपक जाती हैं और धुंधला होने के दौरान धुल नहीं जाती हैं, हीट-फिक्सेशन को 2-3 बार एक लौ के ऊपर उच्चतर रूप से स्मीयर के साथ पास करके किया जाता है। सतह ऊपर की ओर है, ताकि धब्बा गर्म न हो जाए।
6. स्लाइड को एक धुंधला ट्रे पर रखा जाता है और 1 मिनट के लिए प्राथमिक दाग, क्रिस्टल वायलेट के साथ बाढ़ आ जाती है।
7. अतिरिक्त दाग धब्बा से धीरे से बहने वाले नल के पानी के नीचे धोया जाता है, इस तरह से, पानी सीधे धब्बा पर नहीं गिरता है।
8. स्मीयर को 1 मिनट के लिए मॉर्डेंट, चने की आयोडीन से भर दिया जाता है।
9. अतिरिक्त मॉर्डेंट को धीरे से बहने वाले नल के पानी के नीचे धब्बा से दूर धोया जाता है, इस तरह से, पानी सीधे स्मीयर पर नहीं गिरता है।
10. धब्बा decolourising एजेंट, 95% इथेनॉल, 5 सेकंड के लिए, देखभाल करने के साथ बाढ़ आ गई है, ताकि धब्बा अधिक-विघटित न हो।
11. इथेनॉल को धीरे-धीरे बहने वाले नल के पानी के नीचे धुलने से दूर धोया जाता है, ताकि अति-क्षय को रोका जा सके। देखभाल की जाती है, ताकि पानी सीधे धब्बा पर न गिरे।
12. स्मीयर को 1 मिनट के लिए काउंटर-स्टेन, सफारी, के साथ भर दिया गया है।
13. अतिरिक्त काउंटर-दाग धब्बा से धीरे से बहने वाले नल के पानी के नीचे से धोया जाता है, इस तरह से, पानी सीधे धब्बा पर नहीं गिरता है।
14. स्लाइड को बिबुलस पेपर के साथ सुखाया जाता है।
15. स्लाइड को माइक्रोस्कोप के चरण तक ले जाया जाता है और स्मीयर को कम शक्ति और उच्च शुष्क उद्देश्यों के तहत मनाया जाता है।
16. विसर्जन तेल की एक बूंद धब्बा पर डाली जाती है।
17. धब्बा तेल-विसर्जन उद्देश्य के तहत मनाया जाता है।
अवलोकन (तेल-विसर्जन उद्देश्य के तहत):
1. कोशिकाओं का रंग:
बैंगनी-नीला: ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया
गुलाबी-लाल: ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया
2. बैक्टीरिया का आकार:
गोलाकार (कोकस)
रॉड के आकार का (बेसिली)
कोमा जैसा (वाइब्रियो)
सर्पिल (स्पाइरोकेट्स)
3. बैक्टीरिया की व्यवस्था:
जोड़े (डिप्लोबैसिलस / डिप्लोकॉकस)
चौपायों (टेट्राड्स) में
जंजीरों में (स्ट्रेप्टोकोकस / स्ट्रेप्टोबैसिलस)
अंगूर की तरह गुच्छे (स्टेफिलोकोकस)
क्यूबॉइडल (सार्सिना या ऑक्टेट)
4. बैक्टीरिया का आकार:
आंखों के आकलन से, तेल-विसर्जन उद्देश्य के तहत क्षेत्र की ड्राइंग बनाएं।
ग्राम-चर प्रतिक्रिया:
कुछ मामलों में, ग्राम-पॉजिटिव कोशिकाएं ग्राम-नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में दिखाई देती हैं। इसे ग्राम-चर प्रतिक्रिया कहा जाता है।
कारण इस प्रकार हैं:
(ए) ओवर-डिकोलोरिसकरण हो सकता है, जिसके कारण ग्राम-पॉजिटिव कोशिकाएं अपने वायलेट रंग को भी खो देती हैं।
(b) अति-निर्धारण हो सकता है, जिसके कारण ग्राम-पॉजिटिव कोशिकाएँ अपघटन का प्रतिरोध करने की अपनी क्षमता खो देती हैं
(c) यदि जीवाणुओं की पुरानी संस्कृति का उपयोग किया जाता है, तो कोशिका भित्ति के अवयवों का विघटन की अनुमति देने वाली कोशिकाओं की आयु के साथ परिवर्तन हो सकता है।
