एक जीवाणुरोधी की खेती और संवर्धन के लिए प्रयोग

एक जीवाणुरोधी की खेती और संवर्धन के लिए प्रयोग!

सिद्धांत:

बैक्टीरिया का एक निलंबन, एक बैक्टीरियोफेज (वायरस जो बैक्टीरिया को संक्रमित करता है) के लिए अतिसंवेदनशील होता है, जो उस बैक्टीरियोफेज के साथ होता है और एक अग्र प्लेट पर एक संगम लॉन के रूप में विकसित होने की अनुमति देता है।

बैक्टीरियोफेज कण बैक्टीरिया की कोशिकाओं के भीतर विकसित होते हैं और उन्हें ग्रहण करते हैं। बैक्टीरिया कोशिकाओं के लसीका के परिणामस्वरूप बैक्टीरिया के संगम लॉन में स्पष्ट क्षेत्र बनते हैं। इन स्पष्ट क्षेत्रों को 'प्लेक' कहा जाता है। प्रत्येक स्पष्ट क्षेत्र को एक एकल बैक्टीरियोफेज कण द्वारा गठित माना जाता है। इस प्रकार, पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) की संख्या बैक्टीरियोफेज की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है।

बैक्टीरिया की गणना में उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरियोफेज की गणना में सीरियल कमजोर पड़ने की तकनीक का उपयोग किया जाता है। एक नमूने में निहित फेज कणों की संख्या बीजदार अगर प्लेट पर गठित सजीले टुकड़े की संख्या की गणना और इसे कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करके निर्धारित किया जाता है।

एक वैध चरण गणना निर्धारित करने के लिए, प्रति प्लेट पट्टिका की संख्या 300 से अधिक नहीं होनी चाहिए और न ही 30 से कम होनी चाहिए। 300 से अधिक पीएफयू दिखाने वाले प्लेटों को 'बहुत से गिनती करने के लिए' (TNTC) कहा जाता है, जबकि 30% से कम दिखाने वाली प्लेटों को समाप्त कहा जाता है। 'बहुत कम संख्या' (TFTC)।

सामग्री की आवश्यकता:

ट्राइप्टोन ब्रोथ, ट्रिप्टोन सॉफ्ट एगर, ट्रिप्टोन हार्ड एगर, शंक्वाकार फ्लास्क, टेस्ट ट्यूब, निष्फल पेट्री डिश, कॉटन प्लग, बैक्टीरियोफेज की स्टॉक संस्कृति (एक्स: टी ₂ कोलिपेज), बैक्टीरिया के पोषक तत्व शोरबा संस्कृति (एक्स: एशेरिशिया कोलाई बी)। निष्फल पिपेट, आटोक्लेव, गर्म पानी के स्नान, बन्सन बर्नर, लामिना का प्रवाह कक्ष, डिस्पोजल जार, इनक्यूबेटर।

प्रक्रिया:

1. पंद्रह पिपेट (एक स्टेनलेस स्टील पिपेट मामले में) और पांच पेट्री डिश 3 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म हवा ओवन में निष्फल होते हैं। वैकल्पिक रूप से, उन्हें शिल्प कागज के साथ कवर किया जा सकता है, धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जा सकता है और मीडिया (चित्रा 8.3) के साथ एक आटोक्लेव में निष्फल किया जा सकता है।

2. 100 मिलीलीटर शोरबा के लिए आवश्यक 250 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में tryptone ब्रोथ माध्यम या इसके तैयार पाउडर के अवयवों को 100 मिलीलीटर शोरबा में तौला और भंग किया जाता है। आवश्यकतानुसार इसके पीएच को 0.1N HCI या 0.1N NaOH का उपयोग करके 7.5 से समायोजित किया जाता है। कुप्पी को गर्म किया जाता है, यदि आवश्यक हो, तो सामग्री को पूरी तरह से भंग करने के लिए।

3. शोरबा को 10 परीक्षण ट्यूबों (9 मिलीलीटर प्रत्येक), कपास-प्लग में वितरित किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जाता है।

4. मध्यम और 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक ट्रिप्टोन सॉफ्ट अगर मीडियम या इसके तैयार पाउडर के अवयवों को मिलाया जाता है और उन्हें 250 मिली शंक्वाकार फ्लास्क में 100 मिली आसुत जल में मिलाया जाता है। आवश्यकतानुसार इसके पीएच को 0.1N HCI या 0.1N NaOH का उपयोग करके 7.5 से समायोजित किया जाता है। पूरी तरह से मध्यम में अगर को भंग करने के लिए फ्लास्क को गर्म किया जाता है।

5. इस तरल माध्यम को 5 परीक्षण ट्यूबों (2 मिलीलीटर प्रत्येक), कपास-प्लग में वितरित किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जाता है।

6. पीएच के 7.5 के बाद पीएच के बाद 250 मिलीलीटर शंक्वाकार कुप्पी में आसुत जल के माध्यम से ट्रिप्टोन हार्ड एगार मीडियम या इसके तैयार पाउडर के अवयवों को 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक तौला और भंग किया जाता है। फ्लास्क कपास-प्लग किया गया है, शिल्प कागज के साथ कवर किया गया है और धागे या रबर बैंड के साथ बंधा हुआ है।

7. 10 tryptone शोरबा ट्यूब, 5 tryptone नरम अगर ट्यूब और tryptone हार्ड अगर मध्यम युक्त फ्लास्क एक आटोक्लेव में 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस (15 साई दबाव) पर निष्फल रहे हैं।

8. शंक्वाकार फ्लास्क में स्टरलाइज्ड ट्रिप्टोन हार्ड एगर मीडियम को 5 ट्राईपटोन हार्ड एगर प्लेट्स प्राप्त करने के लिए 5 निष्फल पेट्री डिश में डाला जाता है।

9. बैक्टीरियोफेज की स्टॉक संस्कृति का एक मिलीलीटर (एक्स: टी ₂ कोलिपेज) एक नसबंदी पिपेट का उपयोग करके ट्रिप्टोन ब्रोथ ट्यूब (9 मिलीलीटर) में, अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह कक्ष में स्थानांतरित किया जाता है। यह 10 गुना कमजोर पड़ जाता है (यानी 10 ^-1 )। यह अन्य नौ शोरबा ट्यूबों में क्रमिक रूप से पतला होता है, ताकि 10 ^-10 (चित्रा 8.4) का अंतिम कमजोर ^{पड़ना हो} ।

10. 5 निष्फल tryptone नरम अगर ट्यूबों को लिया जाता है और पानी के स्नान पर 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है, ताकि अगर पिघल जाए। ट्यूबों को ठंडा किया जाता है और पिघले हुए नरम नरम ट्यूबों को 45 ° C पर बनाए रखा जाता है।

11. उपर्युक्त 10 ट्यूबों में से अलग-अलग सांद्रता वाले चरणों में, पाँच नलियाँ (यानी 10 ^-5, 10 ^-6, 10 ^-7, 10 ^-8 और 10 ^-9 ) चुनी जाती हैं। इन ट्यूबों से, अलग-अलग निष्फल विंदुक का उपयोग करके, प्रत्येक ट्रिप्टोइन 1 मिली को पांच ट्रिप्टोन सॉफ्ट अगर ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है।

12. बैक्टीरिया के पोषक तत्व शोरबा संस्कृति की दो बूंदें (Ex: Escherichia coli B) असमान रूप से स्थानांतरित हो जाती हैं, अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह कक्ष में, प्रत्येक ट्रिप्टोन नरम अगर ट्यूब में बैक्टीरियोफेज युक्त पांच अलग-अलग सांद्रता में (10 ^-5 से 10 ^-9) )।

13. पांच ट्राइप्टोन सॉफ्ट एगर ट्यूब की सामग्री जिसमें बैक्टीरियोफेज होता है और हाथों की हथेलियों के बीच घुमाकर बैक्टीरिया को तेजी से मिलाया जाता है।

14. सामग्री को असमान रूप से 10 ^-5 से 10 ^{-9 के रूप में} लेबल किए गए पांच ट्रिपप्टोन हार्ड अगर प्लेटों पर डाला जाता है, जिससे एक डबल लेयर प्लेट कल्चर तैयार होता है। प्लेटों को धीरे से घुमाया जाता है और सख्त करने की अनुमति दी जाती है।

15. इनक्यूबेटर में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर औंधा स्थिति में ऊष्मायन किया जाता है।

टिप्पणियों:

1. सभी प्लेटें बैक्टीरिया के लॉन पर स्पष्ट क्षेत्रों के रूप में विकसित होने वाली पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के लिए देखी जाती हैं।

2. 30 और 300 के बीच PFUs वाले केवल प्लेटों की गणना के लिए विचार किया जाता है। प्रत्येक प्लेट पर PFU की संख्या गिनी जाती है। 300 से अधिक पीएफयू दिखाने वाले प्लेटों को 'बहुत अधिक संख्या में' (टीएनटीसी) नामित किया गया है, जबकि 30 से कम पीएफयू दिखाने वाली प्लेटों को 'बहुत कम संख्या में' (टीएफटीसी) नामित किया गया है। ऐसी प्लेटों पर विचार नहीं किया जाता है।

3. टिप्पणियों के आधार पर, स्टॉक फेज संस्कृति के प्रति मिलीलीटर बैक्टीरियोफेज की संख्या की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की जाती है।

फेज / एमएल की संख्या = पीएफयू एक्स कमजोर पड़ने वाले कारक की संख्या

उदाहरण के लिए, यदि पीएफयू की संख्या 10 ^{-7 के} कमजोर पड़ने में 280 है, तो फेज की स्टॉक संस्कृति में फेज की संख्या 280 X 10 ⁷ फेज / एमएल (= 2.80 X 10 ⁹ फेज / एमएल) है।