सीरियल सॉल्यूशन एगर प्लेटिंग विधि या कुल प्लेट काउंट (टीपीसी) विधि द्वारा बैक्टीरिया एक नमूना में मौजूद है
कुल प्लेट गणना (टीपीसी):
सीरियल कमजोर पड़ने वाली अगर प्लेटिंग विधि या कुल प्लेट काउंट (टीपीसी) विधि द्वारा एक नमूने में मौजूद बैक्टीरिया की गणना करने के लिए।
उद्देश्य:
एक निश्चित नमूने में बैक्टीरिया की गतिविधि की सीमा निश्चित परिस्थितियों में होती है, जो मुख्य रूप से इसमें मौजूद बैक्टीरिया की कुल संख्या पर निर्भर करता है, भले ही वे अपनी प्रजाति के हों।
इसलिए, उनके सूक्ष्मजीवविज्ञानी विश्लेषण के दौरान भोजन, पानी, मिट्टी, हवा और ऊतक के नमूनों में मौजूद बैक्टीरिया की कुल संख्या का पता लगाना बहुत बार आवश्यक होता है। जीवाणुओं की इस कुल संख्या में जीवित और मृत दोनों प्रकार के जीवाणु शामिल हैं। ' मृत जीवाणु विकसित नहीं हो सकते और प्रजनन नहीं कर सकते हैं।
यह केवल जीवित बैक्टीरिया (व्यवहार्य बैक्टीरिया) है, जो विशिष्ट जीवाणु गतिविधि के परिणामस्वरूप विकसित और गुणा कर सकते हैं। इसलिए, विभिन्न नमूनों में व्यवहार्य बैक्टीरिया कोशिकाओं की गणना करना बहुत बार आवश्यक होता है। हालाँकि, अधिकांश संसेचन विधियाँ जैसे कि प्रत्यक्ष सूक्ष्म गणना, इलेक्ट्रॉनिक सेल काउंट, रासायनिक विधियाँ और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक पद्धति दोनों जीवित और साथ ही मृत कोशिकाओं की गणना करती हैं।
ये तरीके जीवित और मृत कोशिकाओं के बीच भेदभाव नहीं कर सकते हैं। इसलिए, धारावाहिक कमजोर पड़ने वाली अगर चढ़ाना विधि, जो केवल व्यवहार्य बैक्टीरिया कोशिकाओं की गणना करती है, विभिन्न नमूनों में जीवित व्यवहार्य कोशिकाओं की गिनती के लिए सार्वभौमिक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है।
सिद्धांत:
ठोस नमूने का एक निश्चित वजन जीवाणुओं की एक समरूप निलंबन प्राप्त करने के लिए बाँझ खारा के नौ संस्करणों में असमान रूप से समरूपता है। तरल नमूने का उपयोग सीधे बैक्टीरिया के समरूप निलंबन के रूप में किया जाता है। प्राप्त बैक्टीरिया के निलंबन क्रमिक रूप से पतला होते हैं (10 गुना, 100 गुना, 1000 गुना आदि)। यहाँ 10 -1, 10 -2, 10 -3 आदि को तनुकरण कहा जाता है।
उनके पारस्परिक (10 1, 10 2, 10 3 आदि) को कमजोर पड़ने वाले कारक कहा जाता है। प्रत्येक कमजोर पड़ने से बैक्टीरिया के निलंबन की एक निश्चित मात्रा अगर प्लेटों पर टीका लगाई जाती है और ठीक से फैलती है, ताकि अलग-अलग बैक्टीरिया कोशिकाओं को अलग-थलग कर सकें और उन्हें एक-दूसरे से अलग कर सकें।
जीवाणुओं के जीवाणुओं का टीकाकरण दो तकनीकों में किया जाता है:
1. प्लेट तकनीक डालो
2. प्लेट तकनीक का प्रसार
1. डालो प्लेट तकनीक:
इस तकनीक में, जीवाणुरोधी निलंबन के 1 मिलीलीटर को एक निष्फल पेट्री डिश पर गिरा दिया जाता है और फिर इस पर द्रवीभूत पोषक तत्व अगर माध्यम डाला जाता है। पेट्री डिश को धीरे से घुमाया जाता है, ताकि निलंबन को मध्यम रूप से मिश्रण करने की अनुमति मिल सके। इसे ठंडा करने और जमने की अनुमति है।
2. फैल प्लेट तकनीक:
इस तकनीक में एक तैयार अगर प्लेट पर बैक्टीरिया के निलंबन के 0.1 मिलीलीटर को गिरा दिया जाता है। फिर, निलंबन की बूंद एक निष्फल ग्लास स्प्रेडर द्वारा समान रूप से अगर प्लेट पर फैली हुई है।
त्रुटि को कम करने के लिए, प्रत्येक पतला निलंबन 2-5 प्रतिकृति प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। टीका प्लेटों को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है। इस अवधि के दौरान, अग्र प्लेट पर प्रत्येक अलग-थलग व्यक्तिगत बैक्टीरिया सेल बढ़ता है और एक 'कॉलोनी' नामक बैक्टीरिया कोशिकाओं के एक मैक्रोस्कोपिक दृश्यमान द्रव्यमान का उत्पादन करने के लिए तेजी से बढ़ता है। इस प्रकार, प्लेट पर कालोनियों की संख्या नमूने में बैक्टीरिया की संख्या का प्रतिनिधित्व करती है।
हालांकि, बहुत बार, फैलने के दौरान, कुछ कोशिकाएं ठीक से अलग नहीं हो सकती हैं और कुछ ऐसी अनसेप्ड कोशिकाएं एकल कॉलोनी को जन्म दे सकती हैं। इसके अलावा, कुछ कोशिकाओं में जोड़े, जंजीरों या समूहों में बने रहने की प्रवृत्ति होती है।
यहां, प्रत्येक जोड़ी, चेन या क्लस्टर एक कॉलोनी का निर्माण करता है। इस प्रकार, प्रत्येक कॉलोनी, सख्त अर्थ में, एक भी जीवाणु का प्रतिनिधित्व नहीं करती है। इसीलिए, बैक्टीरिया की गिनती को व्यक्त करने के बजाय 'नहीं। बैक्टीरिया / ग्राम या नमूने का मिलीलीटर ', इसे अक्सर कॉलोनी बनाने की संख्या प्रति ग्राम या एमएल (CFU / ग्राम या एमएल) के रूप में व्यक्त किया जाता है।
मूल नमूने में कुल प्लेट गणना (टीपीसी) की गणना संबंधित कमजोर पड़ने वाले कारकों के साथ सीपीयू की संख्या को गुणा करके की जाती है। मूल नमूने में बैक्टीरिया की संख्या की गणना करते समय, 'गणना के नियमों' का पालन किया जाता है।
सामग्री की आवश्यकता:
पेट्री डिश (15 नग।), 2-मिली पिपेट (10 नग।), 10-मिली पिपेट (1 नं।), टेस्ट ट्यूब (10 नग।), शंक्वाकार फ्लास्क (500 मिली और 1 लीटर -1 नं। प्रत्येक)।, 500 मिली बीकर (2 नग), ग्लास स्प्रेडर, स्टेनलेस स्टील पिपेट केस, क्राफ्ट पेपर, थ्रेड (या रबर बैंड), गैर-शोषक कपास, एथिल अल्कोहल, सोडियम क्लोराइड (NaCl), 0.1N हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCI), 0.1N सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH), आसुत जल, पोषक तत्व अगर, तरल नमूना (जैसे तालाब का पानी / सीवेज का पानी), ठोस नमूना (जैसे मिट्टी / मछली का मांस / सीप का मांस / प्रसंस्कृत भोजन), पीएच पेपर (या पीएच मीटर, मूसल) और मोर्टार (या होमोजेनाइज़र), बन्सन बर्नर, गर्म हवा ओवन, आटोक्लेव, इनक्यूबेटर, लामिना का प्रवाह कक्ष, क्यूबेक कॉलोनी काउंटर।
प्रक्रिया:
1. दस पिपेट (एक स्टेनलेस स्टील पिपेट मामले में), 15 पेट्री डिश और एक जोड़ी मूसल और मोर्टार (या एक होमोजेनाइज़र कप) 3 घंटे के लिए 180 डिग्री सेल्सियस पर गर्म हवा ओवन में निष्फल होते हैं। वैकल्पिक रूप से, उन्हें शिल्प पेपर के साथ कवर किया जा सकता है, धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जाता है और मध्यम (चित्रा 6.6) के साथ आटोक्लेव में निष्फल किया जाता है।
पेट्री डिश की संख्या और तदनुसार उपयोग किए जाने वाले माध्यम की मात्रा की गणना आवश्यक प्रतिकृति और dilutions की संख्या के आधार पर की जाती है। यहाँ, कांच के बर्तन और माध्यम को एकल प्रतिकृति और 10 -6 तक पतला करने के लिए लिया गया है। किसी भी आकस्मिक त्रुटि से बचने के लिए ग्लासवर्सेस की संख्या और नसबंदी के लिए माध्यम की मात्रा थोड़ी अधिक है, क्योंकि नसबंदी एक लंबी प्रक्रिया है।
2. NaCl का 4.25 ग्राम शारीरिक खारा (0.85%) पाने के लिए आसुत जल के 500 मिलीलीटर में भंग कर दिया जाता है। इस खारा समाधान के 225 मिलीलीटर को 500 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में डाला जाता है। इसका मुंह कपास-प्लग है, जिसे शिल्प कागज से ढंका गया है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा गया है। इसका उपयोग ठोस नमूने को पतला करने के लिए पहले मंदक के रूप में किया जाता है।
3. 10 से अधिक परीक्षण ट्यूबों में से प्रत्येक में बाईं ओर खारा के 9.0 मिलीलीटर भी pipetted है। उनके मुंह सूती-प्लग होते हैं, शिल्प कागज से ढके होते हैं और धागे या रबर बैंड से बंधे होते हैं। इनका उपयोग धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए तनु के रूप में किया जाता है।
4. पोषक तत्व अगर मध्यम या 500 मिलीलीटर के लिए आवश्यक इसके तैयार पाउडर के अवयवों को 1 लीटर शंक्वाकार फ्लास्क में 500 मिली और आसुत जल में मिलाया जाता है और हिलाया जाता है।
इसका पीएच एक पीएच पेपर या पीएच मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है और यदि यह कम है तो 0.1N HC1 का उपयोग करके 7.0 से समायोजित किया जाता है और यदि यह 0.1N NaOH का उपयोग करता है। पूरी तरह से मध्यम में अगर को भंग करने के लिए फ्लास्क को गर्म किया जाता है। फिर, इसे कपास-प्लग किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जाता है।
5. 500 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क जिसमें 225 मिलीलीटर खारा होता है, 10 टेस्ट ट्यूब जिसमें 9 मिलीलीटर खारा होता है और 1 लीटर शंक्वाकार फ्लास्क जिसमें 500 मिलीलीटर पोषक तत्व अगर होता है, को 121 ° C (15 psi दबाव) 15 मिनट पर निष्फल कर दिया जाता है। एक आटोक्लेव में।
6. नसबंदी के बाद, स्टरलाइज्ड सामग्री को आटोक्लेव से हटा दिया जाता है और कुछ समय के लिए ठंडा करने की अनुमति दी जाती है, बिना माध्यम को जमने के। माध्यम के ठंडा होने से प्लेटों के अंदर पानी की बूंदों के संघनन और संचय को रोकता है। यदि माध्यम पहले से ही तैयार किया गया है और भंडारण के दौरान जम गया है, तो इसे पूरी तरह से पिघलने तक सावधानी से गर्म करके तरलीकृत करना होगा।
7. अगर प्लेटों को तैयार करने के लिए, निष्फल पोषक तत्व अगर मध्यम ठंडा होने से पहले और गर्म पिघले हुए स्थिति में जम जाता है, इसे 6 निष्फल पेट्री डिश (लगभग 20 मिलीलीटर प्रत्येक) में असमान रूप से डाला जाता है, ताकि पिघला हुआ माध्यम पेट्री के नीचे आ जाए। पूरी तरह से व्यंजन।
फिर, प्लेटों को उनके ढक्कन के साथ कवर किया जाता है और ठंडा करने की अनुमति दी जाती है, ताकि उनमें माध्यम को ठोस किया जा सके। लगभग 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में औंधा स्थिति में प्लेटों और पलकों को रखने से प्लेटों और पलकों की आंतरिक सतह पर घनीभूत होने वाले जल वाष्प का वाष्पीकरण हो सकता है।
8. सॉलिड सैंपल के 25 ग्राम (जैसे मछली का मांस / सीप का मांस / प्रोसेस्ड फूड) वजन होता है और 225 मिलीलीटर निष्फल खारा (मंदक) में असमान रूप से (चित्रा 6.7) होता है। यह 10 गुना कमजोर पड़ने (dilution = 10 -1 ) देता है। तरल नमूने के लिए, 1 मिलीलीटर के नमूने को 9 मिलीलीटर निष्फल खारा ट्यूब में असमान रूप से पाइप किया जाता है। यह भी 10 गुना कमजोर पड़ने (dilution = 10 -1 ) देता है।
9. 10 -1 कमजोर पड़ने का एक मिलीलीटर दूसरे टेस्ट ट्यूब में 9 मिलीलीटर निष्फल खारा में स्थानांतरित किया जाता है। यह 100 गुना कमजोर पड़ने (कमजोर पड़ना = 10 -2 ) देता है। 10 -2 कमजोर पड़ने से, 1 मिलीलीटर एक निष्फल पेट्री डिश में और 0.1 मिलीलीटर एक अगर प्लेट पर गिरा दिया जाता है, उसी पिपेट से। प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए एक अलग निष्फल पिपेट का उपयोग किया जाता है। उपयोग के बाद इसे डिस्पोजल जार में डुबोया जाता है।
10. 10 -2 कमजोर पड़ने की मिलीलीटर एक और टेस्ट ट्यूब में 9 मिलीलीटर निष्फल खारा में स्थानांतरित की जाती है। यह 1000 गुना कमजोर पड़ने (कमजोर पड़ना = 10 -3 ) देता है। 10 -3 कमजोर पड़ने से, 1 मिलीलीटर एक निष्फल पेट्री डिश में और 0.1 मिलीलीटर एक पिपेट से उसी विंदुक पर गिरा दिया जाता है। इसी तरह, 10 -6 क्रमिक रूप से कमजोर पड़ने को जारी रखा जाता है, हर बार 1ml एक निष्फल पेट्री डिश और 0.1 मिलीलीटर एक ही पिपेट से एक अगर प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है।
11. फिर, अगर प्लेटों पर निष्फल रूप से एक निष्फल ग्लास स्प्रेडर द्वारा निलंबन की बूंदों को फैलाया जाता है। प्रत्येक प्लेट में फैलने के बाद, इसे शराब में डुबोकर और एक लौ के ऊपर दिखाकर लौ को निष्फल कर दिया जाता है। यह 'स्प्रेड प्लेट तकनीक' है।
12. 1 मिली बैक्टीरिया के सस्पेंशन वाले पेट्री डिश को प्रत्येक में लिया जाता है और निष्फल तरलीकृत पोषक तत्व अगर में डाला जाता है। उन्हें धीरे से घुमाया जाता है, ताकि निलंबन को समान रूप से मिश्रण करने की अनुमति मिल सके। मध्यम जमने तक प्लेटों को ठंडा होने दिया जाता है। यह 'पियर प्लेट तकनीक' है।
13. फिर, इनक्यूबेटर (चित्रा 6.7) में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर, प्लेटों को उल्टे स्थिति में ऊपर, नीचे गिराया जाता है।
14. एक गैर-इनोकुलेटेड अगर प्लेट को उचित नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रण के रूप में लगाया जाता है क्योंकि इस पर कोई विकास नहीं दिखाया गया है।
टिप्पणियों:
प्लेटों पर जीवाणुओं के उपनिवेशों की संख्या सीधे या एक क्यूबेक कॉलोनी काउंटर की मदद से गिना जाता है। इससे मूल नमूने के प्रति ग्राम या एमएल मौजूद बैक्टीरिया की संख्या की गणना की जाती है। इसे एन्यूमरेशन कहा जाता है।
गणना के नियम:
1. 30 से 300 कॉलोनियों वाले पेट्री डिश पर विचार किया जाना चाहिए।
2. डुप्लिकेट और ट्रिप्लिकेट्स की औसत संख्या (आर 1, आर 2 आर 3 …) केवल तभी मानी जाती हैं जब एक गिनती दूसरे से दोगुनी न हो। यदि कोई अन्य कम मूल्य का दोगुना से अधिक लिया जाता है।
3. डालना प्लेट तकनीक के लिए, बैक्टीरिया की संख्या नं 10 x 10 ग्राम / ग्राम है, जहां सी = कमजोर पड़ने का कारक है। प्रसार प्लेट तकनीक के लिए, बैक्टीरिया की संख्या नं X10 c + 1 / ग्राम है, जहां c = कमजोर पड़ने का कारक है। संख्या (x.yz X 10 m ) के रूप में दो दशमलव स्थानों में बदल जाती है। उदाहरण के लिए, 288 X 10 4 को 2.88 X 10 6 के रूप में व्यक्त किया जाता है।
4. यदि, सभी dilutions में, कॉलोनी की संख्या 300 से अधिक है, तो सबसे अधिक कमजोर पड़ने के लिए गणना की जाती है और यदि सभी dilutions में, यह 30 से कम है, तो सबसे कम कमजोर पड़ने के लिए गणना की जाती है। दोनों ही मामलों में गिनती का प्रतिनिधित्व किया जाता है: प्लेट तकनीक डालने के लिए अनुमानित संख्या X 10 c / gm या ml और फैल प्लेट तकनीक के लिए अनुमानित संख्या X 10 c + 1 / gm या ml।
5. यदि कोई कॉलोनी ली गई किसी भी कमजोर पड़ने की स्थिति में नहीं देखी जाती है, तो इसका प्रतिनिधित्व इस प्रकार किया जाता है: अनुमानित <1 x सबसे कम कमजोर पड़ने वाला।
6. जैसा कि धारावाहिक का कमजोर पड़ना 10 बार होता है, गणितीय रूप से यह स्पष्ट है कि किसी भी दो dilutions में 30 और 300 के बीच कॉलोनियां नहीं हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, यदि 10 -3 में 50 कॉलोनियां हैं, 10 -2 में 500 (यानी) होनी चाहिए 300) और 10 -4 में 5 (यानी <30) कालोनियां होनी चाहिए।
हालांकि, यह वास्तविकता में नहीं होता है, क्योंकि बैक्टीरिया एक समरूप समाधान के रूप में नहीं होते हैं; बल्कि मंदक में एक निलंबन के रूप में होते हैं। यदि काउंटेबल कालोनियों (30 और 300 के बीच) में दो dilutions हैं, तो पहले प्रत्येक कमजोर पड़ने का उपयोग करके कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों / ग्राम या एमएल की संख्या की गणना करें।
यदि एक मान दूसरे से दोगुना से अधिक है, तो निम्न मान की रिपोर्ट करें। यदि नहीं, तो दो मानों का औसत लें और उस मान की रिपोर्ट करें।
