पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के शीर्ष 3 अनुक्रमिक चरण
निम्नलिखित बिंदु पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के शीर्ष तीन अनुक्रमिक चरणों को उजागर करते हैं। अनुक्रमिक चरण हैं: डीनाट्यूरिंग 2. एनीलिंग 3. डीएनए का विस्तार।
अनुक्रमिक चरण # 1. अवमानना:
पहला कदम डीएनए (प्राइमर डीएनए और मूल निवासी डीएनए) दोनों को अस्वीकार करना है। डीएनए के दो स्ट्रैंड के पृथक्करण को दो स्टैड को एक साथ लाते हुए विकृतीकरण के रूप में जाना जाता है जिसे पुन: एनीलिंग या डिजिटलीकरण कहा जाता है (चित्र। 48.1)। डीएनए के विकृतीकरण और पुन: अनावरण की खोज मर्मोर और लेन (1960) द्वारा कृत्रिम रूप से की गई थी।
उनके अनुसार, दोहरे फंसे हुए डीएनए को उच्च तापमान (90-95 ° C) पर गर्म करके और डीएनए के दो स्ट्रैंड (दोहरे फंसे हुए डीएनए) के संकरण या जुड़ने से दो अलग-अलग सिंगल स्ट्रैंड्स (डिनाट्यूरिंग) में विभाजित किया जा सकता है जो कि संभव है तापमान में कमी (50-56 ° C)।
यह मुख्य सिद्धांत है जिस पर पीसीआर कार्य करता है। दूसरा सिद्धांत डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम की मदद से प्राइमर का विस्तार है।
देशी डीएनए, प्राइमर और डीएनए पोलीमरेज़ एंजाइम (टैग पॉलीमरेज़) को एक पीसीआर ट्यूब में जोड़ा जाता है और तापमान को उठाया जाता है और पीसीआर मशीन में घटने और संकरण के लिए उतारा जाता है।
अनुक्रमिक चरण # 2. एनीलिंग:
डीएनए को बदनाम करने के बाद, अगला कदम वांछित लक्ष्य अनुक्रम के विपरीत डीएनए किस्में को संश्लेषित करने के लिए प्राइमर को अनुमति देने के लिए है। एनीलिंग (संकरण) हो सकता है यदि 95 ° C से तापमान 50/56 ° C तक कम हो जाए। तापमान को फिर मशीन में नीचे लाया जाता है।
जैसे ही तापमान कम होता है, देशी डीएनए स्ट्रैंड्स न केवल एक-दूसरे को बांधेंगे बल्कि प्राइमर को भी बांधेंगे। यह विशिष्ट संकरण, या पूरक न्यूक्लियोटाइड्स का "पुनर्संयोजन", पुनर्संयोजन और पुनः संयोजक डीएनए (चित्र। 48.2) के लिए व्यावहारिक आधार प्रदान करता है।
अनुक्रमिक चरण # 3. डीएनए का विस्तार (Taq Polymerase Enzyme की आवश्यकता है):
प्राइमरों ने घोषणा की है कि उन्हें दीक्षा के बिंदु के रूप में ओलिगोन्यूक्लियोटाइड प्राइमर का उपयोग करके बढ़ाया जाना चाहिए। वर्णित है कि डीएनए के संश्लेषण के लिए एंजाइम डीएनए पोलीमरेज़ आवश्यक है। इसलिए, प्राइमर के विस्तार के लिए हमें थर्मो स्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ की आवश्यकता होती है ताकि उच्च तापमान में एंजाइम नष्ट न हो।
थर्मो स्थिर पोलीमरेज़ (Taq पोलीमरेज़) थर्मस जलीय से अलग है। पीसीआर प्रतिक्रिया को करने में Taq पोलीमरेज़ का जबरदस्त फायदा है। इसमें लगभग 70 ° C का एक इष्टतम गतिविधि तापमान होता है और ताप और शीतलन प्रक्रिया के बाद ताजा एंजाइम को प्रत्येक टेस्ट ट्यूब में नहीं जोड़ा जाता है।
थर्मो स्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ को अब अलग-अलग कंपनियों द्वारा (थर्मस एक्वाटिकस के अलावा) अलग-अलग ट्रेड नेम (टीएम) के तहत निर्मित किया जाता है। प्राइमर के विस्तार के लिए, थर्मो स्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ को ट्यूब में जोड़ा जाता है और फिर तापमान को 65-70 ° C तक बढ़ा दिया जाता है।
स्ट्रैंड सेपरेशन (डिसट्यूरिंग), प्राइमर हाइब्रिडाइजेशन (एनीलिंग), और स्ट्रैंड सिंथेसिस (एक्सटेंशन) के बाद के चक्र, एम्पलीफायड सीक्वेंस का उपयोग करके टारगेट सीक्वेंस का एक्सपेंसेबल एम्प्लीफिकेशन सुनिश्चित करते हैं, अगर पिछले चक्र को नए टेम्प्लेट के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, तो तीन साइकल (चित्र 48.2) )।
प्राइमर बनाना:
प्राइमर शॉर्ट सीक्वेंस होते हैं (अक्सर आरएनए) का उपयोग दो न्यूक्लियोटाइड बनाने के लिए किया जाता है, प्राइमर को संदर्भित किया जाता है, डीएनए टुकड़ा के प्रत्येक छोर के लिए एक और 3 -OH अंत प्रदान करता है जिस पर एक डीएनए पोलीमरेज़ एक डीऑक्सीनोन्यूक्लियोटाइड श्रृंखला का संश्लेषण शुरू करता है।
एक सीक्वेंस को अर्थ दिशा में बनाया जाता है, जबकि दूसरे को एंटी-अर्थ दिशा में बनाया जाता है। (चित्र। ४ (.२)। प्राइमर का उपयोग मानार्थ डीएनए स्ट्रैंड के संश्लेषण को प्रधान करने के लिए किया जाता है और इसे इस तरह से डिज़ाइन किया जाता है कि प्राइमरों के बीच डीएनए प्रवर्धित होने के लिए ब्याज का टुकड़ा है।
यदि संदेशवाहक RNA (mRNA) को प्रवर्धित किया जाता है, तो इसे RNA पर निर्भर डीएनए पोलीमरेज़, रिवर्स ट्रांसस्क्रिप्टेज़ द्वारा मानार्थ डीएनए (cDNA) में परिवर्तित किया जाना चाहिए। सीडीएनए कॉम्प्लेक्स को फिर डबल फंसे हुए डीएनए में बदल दिया जाता है, जो बाद की पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट बन जाता है।
यह अक्सर उलट ट्रांसक्रिपटेस पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी पीसीआर) के रूप में जाना जाता है। प्राइमरों को कृत्रिम रूप से उत्पन्न किया जा सकता है या फर्मों से खरीदा जा सकता है।
प्रतिक्रिया पूरी होने के बाद, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्रवर्धित उत्पादों (डीएनए) की कल्पना की जा सकती है। डीएनए अणु की महत्वपूर्ण भौतिक संपत्ति यह है कि प्रत्येक व्यक्ति न्यूक्लियोटाइड में फॉस्फेट समूह से उत्पन्न शुद्ध नकारात्मक चार्ज होता है।
इस प्रकार एक विद्युत क्षेत्र के संपर्क में आने वाले विभिन्न आकारों के टुकड़े आकार के आधार पर अलग-अलग दर पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड की ओर पलायन करते हैं, छोटे टुकड़े बड़े वाले की तुलना में तेजी से पलायन करते हैं। विद्युत आवेश पर आधारित पृथक्करण की इस प्रक्रिया को वैद्युतकणसंचलन कहा जाता है।
डीएनए नमूने, एक प्रतिबंध एंजाइम (एंडोन्यूक्लिअस) द्वारा विभिन्न आकारों के टुकड़ों में पचाए जाने के बाद, एग्रोज जेल या एक्रिलामाइड जैसे मध्यम समर्थन के लिए जोड़े जाते हैं। जेल के छिद्र इसके प्रतिशत पर निर्भर करते हैं और इसकी तुलना एक (आणविक) छलनी से की जा सकती है। इस प्रकार, जेल के माध्यम से डीएनए टुकड़ों की प्रवासन गति डीएनए टुकड़ा आकार और लागू वोल्टेज दोनों पर निर्भर करती है।
विशिष्ट डीएनए टुकड़े को अलग करने और घटाने की प्रक्रिया दक्षिणी सोख्ता है। इस तकनीक का महत्व यह है कि एकल स्ट्रैंड के टुकड़े को केशिका क्रिया द्वारा एक ठोस समर्थन माध्यम (नायलॉन या सेलूलोज़ झिल्ली) में स्थानांतरित किया जा सकता है और स्थायी रूप से हीटिंग द्वारा निर्धारित किया जाता है (चित्र। 48.3)।
इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, डीएनए के पैटर्न को एथिडियम ब्रोमाइड के दाग के साथ इलाज करने के बाद यूवी लैंप के तहत कल्पना की जा सकती है; एथिडियम ब्रोमाइड एक फ्लोरोसेंट डाई है। एग्रोस जेल वैद्युतकणसंचलन ने 100 आधार जोड़े से 60000 आधार जोड़े (60 केबी) तक के टुकड़ों को अलग किया, जबकि, पॉलीक्रैलेमाइड जैल प्रभावी रूप से 1000 आधार जोड़े (1 केबी) से अलग टुकड़े करता है।
पल्स जेल वैद्युतकणसंचलन (PFGE) ने डीएनए के टुकड़े को 2kb तक भी अलग करना संभव बना दिया है। इस प्रक्रिया में विद्युत क्षेत्र को अलग-अलग दिशाओं में बदल दिया जाता है, जिससे डीएनए के अणु प्रत्येक नाड़ी या विद्युत धारा के बीच पुन: प्रवाहित हो जाते हैं। किसी ज्ञात जीन की पहचान करने के लिए यह सबसे अच्छी तकनीक है।
एंडोन्यूक्लियूज 3, 4, 5, 6 या 8 बेस जोड़े को पहचान सकता है और बाजार में उपलब्ध है।
पीसीआर बफर / लवण।
टाक डीएनए पोलीमरेज़ के लिए, बफर नीचे के रूप में बनाया गया है:
50 एमएम केसीआई
कमरे के तापमान पर 10 मिमी ट्रिस-एचसीआई
डायमेथाइल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) और ग्लाइकोल का उपयोग पीसीआर बफ़र्स में सह-विलायक के रूप में किया जाता है, जब लक्ष्य में बहुत अधिक विकृतीकरण तापमान होता है।
डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (dNTPs) आयन कोफ़ेक्टर्स है।
अब जैव प्रौद्योगिकी कंपनियां तैयार समाधान प्रदान कर रही हैं।
मूल सिद्धांत इस प्रकार है:
डीएटीपी (एडीनिन ट्राइफॉस्फेट), डीसीटीपी (साइटोसिन), डीजीटीपी (गनइन), डीयूटीपी (यूरैसिल) चार डीएनटीपी हैं, जिनका उपयोग बेस जोड़ी नियमों के अनुसार प्राइमर का विस्तार करने और अंततः लक्ष्य अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाने के लिए किया जाता है।
DNTP Mg 2+ के साथ बांधता है। एक प्रतिक्रिया में उपस्थित dNTPs की मात्रा इष्टतम एंजाइम गतिविधि के लिए उपलब्ध मुफ्त Mg 2+ की मात्रा निर्धारित करेगी। स्टॉक डीएनटीपी समाधानों को ट्राइस बेस से पीएच 7.0 के साथ बेअसर किया जाना चाहिए और उनकी एकाग्रता को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
सब्सट्रेट और सब्सट्रेट एनालॉग्स:
Taq पोलीमरेज़ बहुत प्रभावी ढंग से काम करता है (dNTP)। हालांकि, टैग डीएनए पोलीमरेज़ सब्सट्रेट के स्थान पर कुछ संशोधित सब्सट्रेट उपलब्ध हैं। वे dogoxigenin- dNTP, biotin-11-dUTP, C7deaza-dGTP, और fluorescently लेबल dNTPS हैं।
पीसीआर के निम्न प्रकार सामान्य उपयोग में हैं:
(1) नेस्टेड पीसीआर;
(2) आरटी-पीसीआर;
(3) एंकर पीसीआर;
(4) असममित पीसीआर;
(5) उलटा पीसीआर;
(6) डीओपी-पीसीआर।
