बैक्टीरिया पर ऑर्थो-नाइट्रोफेनिल गैलेक्टोसाइड टेस्ट, हाइड्रोलाइज करने के लिए उनकी क्षमता का पता लगाने के लिए ऑर्थो-नाइट्रोफिनाइल-पीडी-गैलेक्टोसाइड

बैक्टीरिया पर ऑर्थो-नाइट्रोफेनिल गैलेक्टोसाइड टेस्ट के प्रदर्शन के बारे में जानने के लिए इस लेख को पढ़ें हाइड्रोलाइज ऑर्थो-नाइट्रोफिनाइल-पीडी-गैलेक्टोसाइड की उनकी क्षमता का पता लगाने के लिए!

सिद्धांत:

कुछ बैक्टीरिया लैक्टोज को किण्वित करने की क्षमता रखते हैं। उन्हें 'लैक्टोज-किण्वन बैक्टीरिया' या 'लैक्टोज-फोमेंटर्स' कहा जाता है।

अन्य, जो लैक्टोज को किण्वित नहीं कर सकते, उन्हें लैक्टोज-गैर-किण्वन बैक्टीरिया 'या' लैक्टोज-गैर-फोमेंटर्स 'कहा जाता है।

लैक्टोज-किण्वन करने वाले बैक्टीरिया दो एंजाइमों का उत्पादन कर सकते हैं, जिनका नाम है 'पर्मेस' और 'gal-galactosidase', जो लैक्टोज के किण्वन में शामिल हैं। पेरेसीज़ बैक्टीरिया कोशिकाओं में लैक्टोज के प्रवेश में मदद करता है, जबकि gal-galactosidase हाइड्रोलाइज़ लैक्टोस से ग्लूकोज और गैलेक्टोज़ के लिए, gal-galactosidase एक इंट्रासेल्युलर inducible एंजाइम है, जिसका उत्पादन बैक्टीरिया कोशिकाओं के वातावरण में लैक्टोज़ की उपस्थिति से प्रेरित है।

जबकि लैक्टोज-किण्वन बैक्टीरिया दोनों पर्मेस के साथ-साथ gal-galactosidase का उत्पादन कर सकते हैं, लैक्टोज-गैर-किण्वन बैक्टीरिया पर्मेस पैदा नहीं कर सकता है, लेकिन β-galactosidase का उत्पादन कर सकता है या नहीं कर सकता है। The-galactosidase का उत्पादन करने के लिए लैक्टोज-गैर-किण्वन बैक्टीरिया की क्षमता का पता लगाने के लिए ONPG परीक्षण किया जाता है।

इसके लिए, लैक्टोज की गैर-किण्वन बैक्टीरिया कोशिकाओं की कोशिका झिल्ली को टोल्यूनि को जोड़कर भंग कर दिया जाता है, ताकि यदि मौजूद हो, तो पी-गैलेक्टोसिडेस सहित सभी इंट्रासेल्युलर एंजाइमों को छोड़ दें। एंजाइम, enzym-galactosidase, सब्सट्रेट ऑर्थो- नाइट्रोफिनाइल- gal-D-galctoside (ONPG) को ऑर्थो-नाइट्रोफेनॉल में हाइड्रोलाइज करता है, जो पीले रंग का होता है।

ऑर्थो-नाइट्रोफिनाइल गैलेक्टोसाइड टेस्ट (ONPG टेस्ट) में, टेस्ट बैक्टीरिया को ट्रिपल शुगर आयरन एगर (TSI agar) तिरछे पर उगाया जाता है, जिसमें लैक्टोज होता है। यदि बैक्टीरिया एक लैक्टोज-गैर-किण्वित हैं, जैसा कि लाल बट और लाल तिरछा द्वारा इंगित किया जाता है, बैक्टीरिया का एक मोटा सलाइन खारा में बनाया जाता है, जिसमें टोल्यूनि मिलाया जाता है, जिसके बाद ONPG घोल डाला जाता है। यदि बैक्टीरिया में एंजाइम P-galactosidase का उत्पादन करने की क्षमता है, तो बैक्टीरिया के निलंबन का रंग बदलकर पीला हो जाता है।

सामग्री की आवश्यकता:

टेस्ट ट्यूब, शंक्वाकार फ्लास्क, कॉटन प्लग, इनोक्युलेटिंग लूप, इनोक्युलेटिंग सुई, आटोक्लेव, बन्सन बर्नर, लेमिनर फ्लो चैंबर, डिस्पोज्ड जार, इनक्यूबेटर, टीएसआई एगर, टोल्यूनि, ओ-नाइट्रोफेनिल-ए-डी-गैलेक्टोसाइड (ONPG) घोल, पृथक कालोनियां या बैक्टीरिया की शुद्ध संस्कृतियों।

प्रक्रिया:

1. टीएसआई अगर माध्यम की सामग्री (मुख्य घटकों के रूप में 3 शक्कर और लोहे से युक्त) या इसके तैयार किए गए पाउडर को माध्यम के 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक तौला जाता है और 250 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में आसुत जल के 100 मिलीलीटर में भंग कर दिया जाता है। झटकों और घूमता (चित्रा 7.16)।

2. इसका पीएच एक पीएच पेपर या पीएच मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है और 0.1N HCI का उपयोग करके 7.4 से समायोजित किया जाता है यदि यह कम है या 0.1N NaOH का उपयोग कर रहा है यदि यह कम है।

3. पूरी तरह से मध्यम में अगर को भंग करने के लिए फ्लास्क को गरम किया जाता है।

4. इससे पहले कि यह जम जाए, गर्म पिघली हुई स्थिति में माध्यम को 5 टेस्ट ट्यूब (लगभग 20 मिलीलीटर प्रत्येक) में वितरित किया जाता है।

5. परखनली सूती-प्लग वाली होती हैं, जिन्हें क्राफ्ट पेपर से ढका जाता है और धागे या रबर बैंड से बांधा जाता है।

6. वे आटोक्लेव में 15 मिनट के लिए 121 ° C (15 psi दबाव) पर निष्फल होते हैं।

7. नसबंदी के बाद, उन्हें आटोक्लेव से हटा दिया जाता है और मध्यम और ठंडा करने के लिए तिरछी स्थिति में रखा जाता है, ताकि टीएसआई एगर तिरछा हो सके।

8. परीक्षण बैक्टीरिया को असमान रूप से टीका लगाया जाता है, अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह कक्ष में, बट में चाकू मारकर और एक लौ- निष्फल सुई की मदद से तिरछी सतह पर टकराकर। प्रत्येक टीका के बाद सुई को निष्फल कर दिया जाता है।

9. एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनोलेटेड तिरछी ऊष्मायन किया जाता है।

10. यदि जीवाणु एक लैक्टोज-किण्वक है, तो इसे ONPG परीक्षण के लिए नहीं चुना जाता है। यदि बैक्टीरिया लैक्टोज है - गैर-किण्वक, जैसा कि लाल बट और लाल तिरछा द्वारा इंगित किया गया है, इसे ONPG टेस्ट के लिए चुना जाता है।

11. एक टेस्ट ट्यूब में 0.25 मिलीलीटर खारा होता है, बैक्टीरिया की एक मोटी संस्कृति को एक लौ-निष्फल लूप के माध्यम से डाला जाता है, ताकि बैक्टीरिया का एक मोटा निलंबन बनाया जा सके।

12. टोल्यूनि की एक बूंद को 37 ° C पर 5 मिनट के लिए मिलाया और मिश्रित किया जाता है।

13. ओ-नाइट्रोफेनिल गैलेक्टोसाइड समाधान (ONPG समाधान) जोड़ा जाता है और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फिर रंग परिवर्तन मनाया जाता है। 24 घंटों के बाद फिर से रंग परिवर्तन मनाया जाता है।