एक वायरस के (अलग आरेख के साथ) कोलिफ़ेज का प्रयोग

एक वायरस के कोलीपेगेज का प्रयोग!

सिद्धांत:

बैक्टीरियोफेज या फेज (वायरस) जो बैक्टीरिया को संक्रमित करता है, एस्चेरिचिया कोलाई को कोलिपेज (कोलाई: ई। कोलाई, फेज: बैक्टीरियोफेज) कहा जाता है।

यह विभिन्न प्राकृतिक स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है, जैसे मिट्टी, फेकल पदार्थ और कच्चे सीवेज। इन स्रोतों से इसका अलगाव बहुत आसान नहीं है, क्योंकि यह कम एकाग्रता में मौजूद है।

इसलिए, पहले इसकी संख्या एक संवर्धन कदम से बढ़ जाती है, जिसमें मेजबान बैक्टीरिया (यानी ई। कोलाई) की एक समृद्ध संस्कृति को कोलिफ़ेज-युक्त नमूने में जोड़ा जाता है और ऊष्मायन किया जाता है। कोलीफ़ेज ई। कोलाई को संक्रमित करता है और संख्या में गहराई से वृद्धि करता है। यह कोलिपेज-समृद्ध संस्कृति कण मामले को निपटाने के लिए केन्द्रित है।

जीवाणुरोधी फिल्टर के माध्यम से तलछट को छोड़ दिया जाता है और बैक्टीरिया और अन्य कणों को बनाए रखने के लिए सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर किया जाता है, जबकि कोलिपेज को गुजरने की अनुमति देता है। कोलिपेज में समृद्ध फिल्ट्रेट का उपयोग ई। कोलाई के निलंबन को करने के लिए किया जाता है, जिसे तब एक अग्र प्लेट पर एक संगम लॉन के रूप में विकसित करने की अनुमति दी जाती है।

कोलीफ़ेज ई। कोलाई कोशिकाओं के भीतर बढ़ता है और उन्हें छांटता है। बैक्टीरिया कोशिकाओं के लसीका के परिणामस्वरूप बैक्टीरिया के संगम लॉन पर स्पष्ट क्षेत्र बनते हैं। इन स्पष्ट क्षेत्रों को पट्टिका कहा जाता है। प्रत्येक स्पष्ट क्षेत्र को एक एकल कोलिपेज द्वारा गठित माना जाता है।

सामग्री की आवश्यकता:

पिपेट, शंक्वाकार फ्लास्क, पेट्री डिश, टेस्ट ट्यूब, कॉटन प्लग, बन्स बर्नर, डिस्पोजल जार, सेंट्रीफ्यूज, मेम्ब्रेन फिल्ट्रेशन मेथड, लैमिनर फ्लो चेंबर, आटोक्लेव, इन्क्यूबेटर, बैक्टीरियोफेज ब्रोथ, ट्रिपटोन सॉफ्ट एगर, ट्रिप्टोन हार्ड एगर, न्यूट्रिएंट ब्रोथ कल्चर बैक्टीरिया Escherichia कोलाई (जैसे, ई कोलाई बी), नमूना (जैसे, कच्चे मल)।

प्रक्रिया:

1. पांच पिपेट (एक स्टेनलेस स्टील पिपेट मामले में) और पांच पेट्री डिश को गर्म हवा ओवन में 180 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए निष्फल किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, उन्हें शिल्प कागज के साथ कवर किया जा सकता है, धागे या रबर बैंड के साथ बांधा जा सकता है और मीडिया (चित्रा 8.5) के साथ एक आटोक्लेव में निष्फल किया जा सकता है।

2. बैक्टीरियोफेज शोरबा माध्यम या इसके तैयार किए गए पाउडर की सामग्री, माध्यम के 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक तौला जाता है, एक 250 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में 100 मिलीलीटर आसुत जल में भंग और 7.6 को समायोजित पीएच। फ्लास्क कपास-प्लग है, शिल्प कागज के साथ कवर किया गया है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा गया है।

3. tryptone soft agar medium या इसके तैयार किए गए चूर्ण के अवयवों को, माध्यम के 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक, 250 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में 100 मिलीलीटर आसुत जल में भंग किया जाता है और पीएच 7.5 से समायोजित किया जाता है।

4. इस तरल माध्यम को 5 टेस्ट ट्यूब (प्रत्येक 2 मिलीलीटर), कपास-प्लग में वितरित किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड से बंधा होता है।

5. ag.५ के माध्यम से पीएच समायोजन के बाद २५० मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में १५० मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में १०० मिलीलीटर माध्यम में ट्रिप्टोन हार्ड एगर मीडियम या इसके तैयार किए गए पाउडर के अवयवों को तौला जाता है। फ्लास्क कपास-प्लग है, शिल्प कागज के साथ कवर किया गया है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा गया है।

6. बैक्टीरियोफेज शोरबा युक्त फ्लास्क, 5 ट्रिप्टोन सॉफ्ट एगर ट्यूब, फ्लास्क जिसमें ट्रिप्टोन हार्ड एगार मीडियम और एक खाली कॉटन प्लग 250 मिली शंक्वाकार फ्लास्क आटोक्लेव में 15 मिनट के लिए 121 ° C (15i प्रेशर) पर निष्फल होते हैं।

7. शंक्वाकार फ्लास्क में निष्फल ट्राइप्टोन हार्ड एगर मीडियम को 5 स्टेरिलाइज्ड पेट्री डिश में डाला जाता है और इसे ठंडा होने दिया जाता है, ताकि 5 ट्रिप्टोन हार्ड एगर प्लेट्स मिल सकें।

8. सूती-प्लग युक्त निष्फल खाली 250 मिली शंक्वाकार फ्लास्क, 5 मिली निष्फल बैक्टीरियोफेज शोरबा के 5 मिलीलीटर, ई। कोलाई बी शोरबा कल्चर के 45 मिलीलीटर और कच्चे सीवेज के 45 मिली लीटर को असमान रूप से स्थानांतरित कर दिया जाता है, अधिमानतः लामिना का प्रवाह कक्ष (चित्र 8.6) में ।

9. फ्लास्क को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है, ताकि मेजबान बैक्टीरिया कोशिकाओं (ई कोलाई बी की कोशिकाओं) के भीतर सीवेज में कोलिपेज को आगे बढ़ने की अनुमति मिल सके।

10. कुप्पी की सामग्री को 100 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में डाला जाता है और कणों को बसाने के लिए एक अपकेंद्रित्र में 20 मिनट के लिए 2500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। तलछट का त्याग कर दिया जाता है।

11. कोलीनफेज में समृद्ध सतह पर तैरनेवाला, एक झिल्ली निस्पंदन तंत्र के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है। अवशेषों को छोड़ दिया जाता है।

12. पांच निष्फल ट्रिप्टोन नरम अगर ट्यूबों को लिया जाता है और 100 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान पर गरम किया जाता है, ताकि अगर पिघल जाए। ट्यूबों को ठंडा किया जाता है और पानी के स्नान पर 45 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।

13. एक जीवाणुरहित विंदुक का उपयोग करके, बैक्टीरिया-मुक्त छानना के 1, 2, 3, 4 और 5 बूंदों के साथ, कोलिपेज में समृद्ध को पांच ट्रिप्टोन नरम अगर ट्यूबों में असमान रूप से स्थानांतरित किया जाता है।

14. प्रत्येक ट्रिप्टोन नरम अगर ट्यूब के लिए, Escherichia कोलाई बी के पोषक तत्व शोरबा की 0.1 मिलीलीटर मात्रा को अनैतिक रूप से स्थानांतरित किया जाता है।

15. वायरस, कोलीफ़ेज और बैक्टीरिया वाले पांच ट्रिप्टोन नरम अगर ट्यूबों की सामग्री, ई। कोलाई बी तेजी से हाथों की हथेलियों के बीच ट्यूबों को घुमाकर मिश्रित होती है।

16. सामग्री को पांच ट्रिपप्टोन हार्ड एगर प्लेट्स (1 से 5 बूंदों के रूप में लेबल) पर डाला जाता है, जिससे डबल लेयर कल्चर तैयारी होती है। प्लेटों को धीरे से घुमाया जाता है और सख्त करने की अनुमति दी जाती है।

17. एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक औंधा स्थिति में इनकोलेटेड प्लेटों को ऊष्मायन किया जाता है।

टिप्पणियों:

1. सभी प्लेटें बैक्टीरिया के लॉन पर स्पष्ट क्षेत्रों के रूप में विकसित होने वाली पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू) के लिए देखी जाती हैं। पट्टिका गठन संस्कृति में कोलिफ़ेज की उपस्थिति का संकेत है।

2. प्रत्येक पट्टिका पृथक कोलिफ़ेज की समृद्ध वृद्धि का प्रतिनिधित्व करती है।

3. पट्टिकाओं की संख्या सभी प्लेटों में गिनी जाती है और निम्नानुसार सारणीबद्ध होती है (तालिका 8.1)।

सारणी 8.1: कोलिपेज की संख्या का अवलोकन :