हाइड्रोलाइज डीएनए (चित्रा के साथ) के लिए उनकी क्षमताओं का पता लगाने के लिए बैक्टीरिया पर डीऑक्सीराइबोन्यूक्लाइज टेस्ट

बैक्टीरिया को हाइड्रोलाइज डीएनए (चित्रा के साथ) में उनकी क्षमताओं का पता लगाने के लिए बैक्टीरिया पर डीऑक्सीराइबोन्यूक्लाइज टेस्ट (DNase टेस्ट)!

सिद्धांत:

कुछ बैक्टीरिया में ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के लिए डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए) को हाइड्रोलाइज़ करने की क्षमता होती है, क्योंकि वे बाह्य कोशिकीय एंजाइम 'डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिज़' (डीनेज़) का उत्पादन कर सकते हैं।

जबकि डीएनए हाइड्रोक्लोरिक एसिड द्वारा अपारदर्शिता द्वारा अवक्षेपित हो जाता है, इसके हाइड्रोलाइज्ड अंत उत्पाद, ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, हाइड्रोक्लोरिक एसिड द्वारा अवक्षेपित नहीं होते हैं, जिसके लिए वे ऐसी अपारदर्शिता उत्पन्न नहीं करते हैं; बल्कि पारदर्शिता का उत्पादन करें।

DNase परीक्षण में, परीक्षण बैक्टीरिया डीएनए युक्त अगर प्लेटों पर उगाए जाते हैं। बैक्टीरिया की कालोनियों के दिखाई देने के बाद, प्लेटों को हाइड्रोक्लोरिक एसिड से भर दिया जाता है। यदि बैक्टीरिया में डीएनए को हाइड्रोलाइज करने की क्षमता है, तो इसकी कॉलोनियां अपने आसपास के क्षेत्रों में माध्यम में डीएनए को हाइड्रोलाइज करती हैं, जबकि प्लेटों के बाकी क्षेत्रों में निर्जलित डीएनए होते हैं।

नतीजतन, जब हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ बाढ़ आती है, तो कॉलोनियों के चारों ओर पारदर्शी स्पष्ट क्षेत्र बनते हैं, क्योंकि हाइड्रोलाइड उत्पादों, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स, उनके चारों ओर गठित हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ अवक्षेप नहीं बनाते हैं।

दूसरी ओर, प्लेटों के बाकी क्षेत्र अपारदर्शी हो जाते हैं, क्योंकि इन क्षेत्रों में निर्जलित डीएनए हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ अवक्षेपित हो जाते हैं। यदि हाइड्रोक्लोरिक एसिड के बजाय टोल्यूइडिन ब्लू का उपयोग किया जाता है, तो एक गुलाबी गुलाबी प्रभामंडल केवल कॉलोनियों के आसपास पैदा होता है।

सामग्री की आवश्यकता:

पेट्री डिश, शंक्वाकार फ्लास्क, कॉटन प्लग, इनोक्युलेटिंग लूप, आटोक्लेव, बन्सन बर्नर, लैमिनर फ्लो चैंबर, डिस्पोजल जार, इनक्यूबेटर, डीनेसे अगर, इन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (या 0.1% टोल्यूडिन ब्लू), पृथक कालोनियों या बैक्टीरिया की शुद्ध संस्कृतियों।

प्रक्रिया:

1. दो पेट्री डिश को साफ किया जाता है, शिल्प कागज के साथ कवर किया जाता है और धागे या रबर बैंड (चित्रा 7.23) के साथ बांधा जाता है। इस चरण के साथ-साथ चरण 6 पर पेट्री डिश के नसबंदी को छोड़ दिया जाता है, अगर ओवन-निष्फल पेट्री डिश सीधे उपयोग किया जाता है।

2. DNase अगर माध्यम के अवयवों (मुख्य घटक के रूप में डीएनए युक्त) या इसके तैयार किए गए पाउडर को माध्यम के 100 मिलीलीटर के लिए आवश्यक तौलना और 250 मिलीलीटर आसुत जल के 100 मिलीलीटर आसुत जल में मिलाते हुए और झुलस कर भंग कर दिया जाता है।

3. इसका पीएच एक पीएच पेपर या पीएच मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है और अगर यह कम है तो 0.1N HCI का उपयोग करते हुए या 0.1N HCI का उपयोग करके 7.2 पर समायोजित किया जाता है।

4. पूरी तरह से मध्यम में अगर को भंग करने के लिए फ्लास्क को गरम किया जाता है।

5. फ्लास्क कपास-प्लग है, शिल्प कागज के साथ कवर किया गया है और धागे या रबर बैंड के साथ बांधा गया है।

6. दो पेट्री डिश और शंक्वाकार फ्लास्क जिसमें DNase agar माध्यम होते हैं, आटोक्लेव में 15 मिनट के लिए 121 ° C (15 psi दबाव) पर निष्फल होते हैं।

7. नसबंदी के बाद, उन्हें आटोक्लेव से हटा दिया जाता है और कुछ समय के लिए ठंडा करने की अनुमति दी जाती है, माध्यम को जमने की अनुमति के बिना। माध्यम के ठंडा होने से प्लेटों के अंदर पानी की बूंदों के संघनन और संचय को रोकता है। यदि माध्यम पहले से ही तैयार किया गया है और भंडारण के दौरान जम गया है, तो इसे पूरी तरह से पिघलने तक सावधानी से गर्म करके तरलीकृत करना होगा।

8. DNase अगर प्लेटें तैयार करने के लिए, निष्फल DNase अगर मध्यम ठंडा होने से पहले और जम जाता है, गर्म पिघली हुई स्थिति में, इसे असमान रूप से डाला जाता है, अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह कक्ष के अंदर, दो निष्फल पेट्री डिश (लगभग 20 मिलीलीटर प्रत्येक) में, ताकि पिघला हुआ माध्यम पेट्री डिश के निचले हिस्से को पूरी तरह से कवर करता है।

फिर, प्लेटों को उनके ढक्कन के साथ कवर किया जाता है और ठंडा करने की अनुमति दी जाती है, ताकि उनमें माध्यम को ठोस किया जा सके। लगभग 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में औंधा स्थिति में प्लेटों और पलकों को रखने से प्लेटों और पलकों की आंतरिक सतह पर घनीभूत होने वाले जल वाष्प का वाष्पीकरण हो सकता है।

9. प्रत्येक प्लेट को नीचे की तरफ चार तिमाहियों में चिह्नित किया गया है।

9. टेस्ट बैक्टीरिया का "स्पॉट इनोक्यूलेशन" असमान रूप से, अधिमानतः एक लामिना का प्रवाह कक्ष के अंदर किया जाता है, प्रत्येक तिमाही के केंद्र पर एक लौ-निष्फल लूप की मदद से बैक्टीरिया का एक स्पॉट (या छोटा धब्बा) बनाकर। लूप को प्रत्येक इनोक्यूलेशन के बाद निष्फल किया जाता है।

11. inoculated प्लेटों को औंधा स्थिति में ऊष्मायन किया जाता है, ऊपर से नीचे 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 से 48 घंटों के लिए एक इनक्यूबेटर में जब तक कि बैक्टीरिया की कॉलोनियां दिखाई नहीं देती हैं।

12. प्लेटें 1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (या 0.1% टोलिडीन ब्लू) के समाधान से भर जाती हैं।