एक अलग नमूने में मौजूद अलग-अलग बैक्टीरिया को अलग करना और उनकी शुद्ध संस्कृतियों को बनाए रखना
किसी दिए गए नमूने में मौजूद विभिन्न जीवाणुओं को अलग करना और उनकी शुद्ध संस्कृतियों को बनाए रखना है।
उद्देश्य:
प्रकृति में पाए जाने वाले बैक्टीरिया अलग-अलग प्रजातियों के रूप में नहीं होते हैं, बल्कि वे विभिन्न प्रजातियों की मिश्रित आबादी के रूप में पाए जाते हैं।
इसलिए, बैक्टीरिया की व्यक्तिगत प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए, उन्हें पहले मिश्रित आबादी से अलग करना आवश्यक है। इस प्रक्रिया को 'बैक्टीरिया का अलगाव' कहा जाता है।
यह एक ठोस माध्यम की सतह पर बैक्टीरिया की मिश्रित आबादी को असतत कालोनियों में विकसित करके पूरा किया जाता है। 'कालोनियों' अलग-अलग हैं, ठोस माध्यम की सतह पर विकसित बैक्टीरिया की व्यापक रूप से दिखाई देने वाली जनता, प्रत्येक एक एकल जीवाणु के गुणन का प्रतिनिधित्व करती है।
जैसा कि प्रत्येक कॉलोनी एकल जीवाणु के विकास और दोहराया गुणन से आती है, कॉलोनी में मौजूद सभी बैक्टीरिया एक ही प्रजाति के हैं। इस प्रकार, प्रत्येक कॉलोनी बैक्टीरिया की एक ही प्रजाति की एक बहुत बड़ी आबादी का प्रतिनिधित्व करती है।
इन कालोनियों को अलग-अलग पोषक तत्व एगर स्लांट्स में स्थानांतरित किया जाता है और वहां बढ़ने की अनुमति दी जाती है। बैक्टीरिया की अलग-अलग प्रजातियां, अलग-अलग प्रजातियों पर उगती हैं जिन्हें 'शुद्ध संस्कृतियां' कहा जाता है। हर 15 से 30 दिनों में, उन्हें ताजे तिरछे स्थान पर स्थानांतरित कर दिया जाता है, ताकि वे अति-भीड़, पोषक तत्वों की कमी और चयापचयों के संचय के कारण अपनी मूल विशेषताओं को न खोएं।
इस तरह, नियमित अंतराल पर ताजा तिरछा करने के लिए बार-बार स्थानांतरण द्वारा बैक्टीरिया की शुद्ध संस्कृतियों को प्रयोगशाला में बनाए रखा जाता है। इस प्रक्रिया को 'शुद्ध संस्कृति के रखरखाव' के रूप में जाना जाता है। शुद्ध संस्कृतियों को विभिन्न धुंधला, जैव रासायनिक, सीरोलॉजिकल और आणविक तकनीकों के साथ-साथ उनके भविष्य के उपयोग के लिए उनकी बाद की पहचान के लिए प्रयोगशाला में रखा जाता है।
'स्टॉक कल्चर' मानक शुद्ध संस्कृतियाँ हैं, जिनकी पहचान जीनस, प्रजाति, उप-प्रजातियों, प्रकार, या उप-प्रकार के स्तर पर अंतर्राष्ट्रीय स्तर पर स्थापित की गई है। वे अंतरराष्ट्रीय स्तर पर मान्यता प्राप्त माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं में बनाए रखा जाता है।
अन्य प्रयोगशालाएँ उन्हें इन प्रयोगशालाओं से प्राप्त कर सकती हैं और नियमित अंतराल पर ताजे तिरछे स्थान पर बार-बार हस्तांतरण द्वारा अपनी प्रयोगशालाओं में अपनी स्टॉक संस्कृतियों के रूप में बनाए रख सकती हैं। इन प्रयोगशालाओं में मानक स्टॉक संस्कृतियों के साथ उनकी विशेषताओं की तुलना करके प्राप्त शुद्ध संस्कृतियों की पुष्टि के लिए उनका उपयोग किया जाता है।
सिद्धांत:
किसी दिए गए पदार्थ (ठोस, तरल या सतह) में मौजूद जीवाणुओं की मिश्रित आबादी को पोषक प्लेटों में फैलकर प्लेट या स्ट्रीक प्लेट विधि द्वारा विकसित किया जाता है जैसा कि पहले 'बैक्टीरिया की खेती' के तहत वर्णित है। अगर प्लेट पर पाए जाने वाले प्रत्येक पृथक कॉलोनी में बैक्टीरिया की एक प्रजाति होती है, क्योंकि प्रत्येक कॉलोनी एक एकल जीवाणु से बढ़ती है।
इस प्रकार, बैक्टीरिया को दो तकनीकों द्वारा अगर प्लेटों पर अलग किया जाता है:
(ए) स्प्रेड प्लेट तकनीक
(b) स्ट्रीक प्लेट तकनीक
प्रतिनिधि उपनिवेश (असमान विशेषताओं वाले उपनिवेश) का चयन किया जाता है और शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए अलग-अलग अगर स्लाटरों को असंगत रूप से निष्क्रिय कर दिया जाता है। प्रत्येक 15 से 30 दिनों के बाद, उन्हें इन शुद्ध संस्कृतियों के रखरखाव के लिए ताजा तिरछा में स्थानांतरित किया जाता है।
सामग्री की आवश्यकता:
टेस्ट ट्यूब (5 नग), 250 मिली शंक्वाकार फ्लास्क (1 नं।), 0.1N NaOH, 0.1N HCI, आसुत जल, पोषक तत्व अगर, गैर शोषक कपास, लूप, शिल्प कागज, धागा (या रबर बैंड), पीएच पेपर (या पीएच मीटर), बन्सन बर्नर, आटोक्लेव, लामिना का प्रवाह कक्ष, इनक्यूबेटर, बैक्टीरिया की अलग-अलग कॉलोनियों वाली प्लेट (फैल प्लेट या स्ट्रीक प्लेट)।
प्रक्रिया:
1. पोषक तत्व अगर मध्यम या 100 मिलीलीटर माध्यम के लिए आवश्यक इसके तैयार पाउडर के अवयवों को 250 मिलीलीटर शंक्वाकार फ्लास्क में हिलाकर और घूमकर (चित्रा 6.4) द्वारा 100 मिलीलीटर आसुत जल में तौला और भंग किया जाता है।
2. इसका पीएच एक पीएच पेपर या पीएच मीटर का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है और 0.1N HC1 का उपयोग करके 7.0 से समायोजित किया जाता है यदि यह अधिक है या 0.1N NaOH का उपयोग कर रहा है यदि यह कम है।
3. पूरी तरह से मध्यम में अगर को भंग करने के लिए फ्लास्क को गरम किया जाता है।
4. इससे पहले कि यह जम जाए, गर्म पिघली हुई स्थिति में माध्यम को 5 टेस्ट ट्यूब (लगभग 20 मिलीलीटर प्रत्येक) में वितरित किया जाता है।
5. परखनली सूती-प्लग वाली होती हैं, जिन्हें क्राफ्ट पेपर से ढका जाता है और धागे या रबर बैंड से बांधा जाता है।
6. वे आटोक्लेव में 15 मिनट के लिए 121 ° C (15 psi दबाव) पर निष्फल होते हैं।
7. नसबंदी के बाद, उन्हें आटोक्लेव से हटा दिया जाता है और मध्यम और ठंडा करने के लिए तिरछी स्थिति में रखा जाता है। इन परीक्षण ट्यूबों में तिरछी स्थिति में ठोस पोषक तत्व अगर युक्त होते हैं, जिन्हें 'पोषक तत्व अगर' कहा जाता है।
8. चरण 10 और 11 को सड़न रोकनेवाला तकनीक को एक लामिना का प्रवाह कक्ष में अधिमानतः किया जाना चाहिए। निष्फल मीडिया या संस्कृतियों वाले कंटेनरों के मुंह को कॉटन प्लग को हटाने और वापस डालने से पहले बन्स बर्नर की लौ पर दिखाया जाना चाहिए।
लूप्स, उपयोग से पहले लाल गर्म और फिर 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए गर्म करके लौ पर निष्फल होना पड़ता है। बहुत गर्म होने पर उनका उपयोग कभी नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि वे जब छूते हैं तो रोगाणुओं को मारते हैं।
9. पिछले प्रयोग में, यदि अलग-अलग कालोनियों को फैल प्लेट या स्ट्रीक प्लेट पर देखा जा सकता है, तो असंतुष्ट विशेषताओं वाले पांच उपनिवेशों को प्रतिनिधि उपनिवेश के रूप में चुना जाता है।
10. एक लूप को लौ पर निष्फल कर दिया जाता है और प्रत्येक प्रतिनिधि कॉलोनियों से बैक्टीरिया का एक लूप असमान रूप से लिया जाता है। लूप को अगर स्लांट में पेश किया जाता है, ताकि बैक्टीरिया का लूप तिरछा के अंत में चला जाए। लूप को तिरछी सतह पर स्पर्श करते हुए लहराते हुए बाहर की ओर ले जाया जाता है, जिससे लहरदार रेखा बनती है।
11. लूप लौ-स्टरलाइज़ है और इसी तरह से चार प्रतिनिधि कॉलोनियों के बाकी हिस्सों को अलग-अलग चार स्लाइडों में बाईं ओर अलग किया जाता है। लूप को प्रत्येक इनोक्यूलेशन के बाद निष्फल किया जाता है।
12. एक इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच इनोकेटेड तिरछे ऊष्मायन होते हैं।
अवलोकन (सांस्कृतिक विशेषताएं):
(i) विकास के साथ एक लहरदार रेखा जिसकी लंबाई देखी गई है:
विकास हुआ है।
तिरछी विशेषताओं के लिए तिरछा इस प्रकार मनाया जाता है (चित्र 6.5)।
1. विकास की प्रचुरता:
विकास की मात्रा को मामूली, मध्यम या बड़े के रूप में नामित किया गया है।
2. रंजकता:
क्रोमोजेनिक सूक्ष्मजीव इंट्रासेल्युलर पिगमेंट का उत्पादन कर सकते हैं जो जीवों के रंग के लिए जिम्मेदार हैं जैसा कि सतह के उपनिवेशों में देखा जाता है। अन्य जीवों में अतिरिक्त घुलनशील रंजक होते हैं जो कि माध्यम में उत्सर्जित होते हैं और एक रंग का उत्पादन भी करते हैं। हालांकि, अधिकांश जीव गैर-क्रोमोमेरिक हैं और सफेद से ग्रे दिखाई देंगे।
3. ऑप्टिकल विशेषताओं:
वृद्धि के माध्यम से प्रेषित प्रकाश की मात्रा के आधार पर ऑप्टिकल विशेषताओं का मूल्यांकन किया जा सकता है।
इन विशेषताओं का वर्णन इस प्रकार है:
(ए) अपारदर्शी: कोई प्रकाश संचरण नहीं।
(ख) पारभासी: आंशिक प्रकाश संचरण।
(सी) पारदर्शी: पूर्ण प्रकाश संचरण।
4. फॉर्म
कृषि सतह पर विकास की एकल रेखा लकीर का स्वरूप निम्नानुसार है:
(ए) फ़िलिफ़ॉर्म: चिकनी किनारों के साथ निरंतर, थ्रेडलाइज़ वृद्धि।
(ख) इचिनेट: अनियमित किनारों के साथ निरंतर, थ्रेडलाइड वृद्धि।
(सी) मनके: अर्द्ध-संगम कालोनियों के लिए गैर-संगम।
(घ) प्रयास: पतला, फैलता हुआ विकास।
(ई) आर्कबर्सेंट: वृक्ष जैसी वृद्धि।
(f) Rhizoid: जड़ जैसी वृद्धि।
(ii) टीकाकरण की रेखा के साथ कोई वृद्धि नहीं:
इनोक्यूलेशन की दोषपूर्ण तकनीक, इनोक्यूलेशन बार-बार बैक्टीरिया का सी एन्यूमरेशन है।
सी। जीवाणु का संसेचन:
एक निश्चित नमूने में बैक्टीरिया की गतिविधि की सीमा निश्चित परिस्थितियों में होती है, जो मुख्य रूप से इसमें मौजूद बैक्टीरिया की कुल संख्या पर निर्भर करता है, भले ही वे अपनी प्रजाति के हों। इसलिए, उनके सूक्ष्मजीवविज्ञानी विश्लेषण के दौरान भोजन, पानी, मिट्टी, हवा और ऊतक के नमूनों में मौजूद बैक्टीरिया की कुल संख्या का पता लगाना बहुत बार आवश्यक होता है।
किसी दिए गए नमूने में जीवाणुओं की संख्या का अनुमान लगाना 'जीवाणुओं का संचय' कहलाता है। नीचे दिए गए अनुसार जीवाणुओं की गणना के विभिन्न तरीके हैं। इन सभी तरीकों को एक समरूप निलंबन में मौजूद होने के लिए बैक्टीरिया की आवश्यकता होती है।
यही कारण है कि तरल नमूनों को बैक्टीरिया के समरूप निलंबन माना जाता है और सीधे उपयोग किया जाता है, जबकि ठोस नमूनों को बाँझ खारा समाधान में समरूप किया जाता है, ताकि बैक्टीरिया के समरूप निलंबन प्राप्त किया जा सके।
आमतौर पर इस्तेमाल नहीं किया जाता है:
(I) प्रत्यक्ष तरीके:
(a) प्रत्यक्ष सूक्ष्म गणना
(b) इलेक्ट्रॉनिक सेल काउंटर
(II) अप्रत्यक्ष तरीके:
(c) रासायनिक विधियाँ
(घ) टर्बिडिमेट्रिक विधि
(ई) झिल्ली फिल्टर गिनती
सबसे ज़्यादा उपयोग हुआ:
(च) सीरियल कमजोर पड़ने वाली अगर चढ़ाना विधि या कुल प्लेट गणना विधि (टीपीसी विधि)
(ए) प्रत्यक्ष माइक्रोस्कोपिक गणना:
इस विधि में, बैक्टीरिया के समरूप निलंबन के एक विभाज्य में मौजूद बैक्टीरिया की संख्या सीधे एक माइक्रोस्कोप के तहत गिना जाता है और नमूने में बैक्टीरिया की कुल संख्या गणितीय रूप से निर्धारित की जाती है।
इस विधि का लाभ यह है कि, यह बहुत तेजी से होता है। नुकसान यह है कि, जीवित (व्यवहार्य) और मृत कोशिकाओं को गिना जाता है और विधि प्रति मिलीलीटर एक मिलियन से कम जीवाणुओं की आबादी के प्रति संवेदनशील नहीं है।
गिनती दो तरीकों से की जा सकती है:
(i) पेट्रॉफ-हौसर चैंबर:
यह एक विशेष गिनती कक्ष है, जिसमें बैक्टीरिया के समरूप निलंबन का एक विभाज्य सीधे माइक्रोस्कोप के तहत गिनती के लिए रखा जाता है।
(ii) नस्ल स्मियर:
स्लाइड पर 1 मिमी 2 के एक क्षेत्र तक सीमित स्मीयरों का उपयोग करके बैक्टीरिया कोशिकाओं को सीधे माइक्रोस्कोप के तहत गिना जाता है। यह मुख्य रूप से दूध में बैक्टीरिया की गणना के लिए उपयोग किया जाता है।
(बी) इलेक्ट्रॉनिक सेल काउंटर:
बैक्टीरिया सेल की संख्या को सीधे गिनने के लिए 'सेल्टर काउंटर' जैसे इलेक्ट्रॉनिक सेल काउंटर का उपयोग किया जाता है। एक संवाहक तरल पदार्थ में तैयार बैक्टीरिया कोशिकाओं का एक समरूप निलंबन एक मिनट के छिद्र से गुजरने की अनुमति है, जिसके पार एक विद्युत प्रवाह होता है।
छिद्र में प्रतिरोध इलेक्ट्रॉनिक रूप से दर्ज किया गया है। जब एक कोशिका छिद्र के माध्यम से गुजरती है, तो गैर-कंडक्टर होने के नाते, यह प्रतिरोध को पल-पल बढ़ाता है। समय-समय पर प्रतिरोध की संख्या इलेक्ट्रॉनिक रूप से दर्ज की जाती है, जो निलंबन में मौजूद बैक्टीरिया की संख्या को इंगित करता है।
इस पद्धति का लाभ यह है कि, यह बहुत तेजी से है। नुकसान यह है कि, जीवित (व्यवहार्य) और मृत कोशिकाएं दोनों ही गिने जाते हैं और उपकरण बैक्टीरिया कोशिकाओं और निष्क्रिय कणों के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं।
(सी) रासायनिक तरीके:
ये विधियां उन पदार्थों की मात्रा का अनुमान लगाती हैं, जिनमें मुख्य रूप से रसायन होते हैं, जो बैक्टीरिया की आबादी में वृद्धि के साथ बढ़ता है।
मुख्य पैरामीटर निम्नानुसार हैं:
(i) प्रोटीन सांद्रता
(ii) डीएनए सांद्रता
(iii) सूखा वजन
(iv) कार्बन डाइऑक्साइड का उत्पादन
(v) ऑक्सीजन का उत्थान
(vi) लैक्टिक एसिड का उत्पादन
(d) टर्बिडीमेट्रिक विधि:
जब बैक्टीरिया तरल पोषक तत्व से भरपूर मीडिया (जैसे पोषक तत्व शोरबा) में उगाए जाते हैं, तो उनका विपुल विकास मीडिया को अशांत बना देता है, क्योंकि बैक्टीरिया कोशिकाएं ज्यादातर उनमें निलंबित रहती हैं। मीडिया में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि के साथ मैलापन बढ़ता है। जैसे-जैसे मैलापन बढ़ता है, मीडिया का 'अवशोषक' या 'ऑप्टिकल घनत्व (OD)' बढ़ता जाता है।
मीडिया में बैक्टीरिया कोशिकाओं के निलंबन के आयुध डिपो को 600 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है। निलंबन में बैक्टीरिया कोशिकाओं की संख्या बैक्टीरिया के विभिन्न ज्ञात सांद्रता के लिए आयुध डिपो मूल्यों की साजिश रचने के लिए तैयार एक मानक वक्र के साथ आयुध डिपो की तुलना करके पाई जाती है। विधि तेजी से है, लेकिन 10 मिलियन से अधिक कोशिकाओं के जीवाणु निलंबन तक सीमित है।
(ई) झिल्ली फ़िल्टर गणना:
इस विधि का उपयोग तब किया जाता है, जब किसी तरल नमूने में बैक्टीरिया की संख्या बहुत कम होती है। जीवाणुओं की सांद्रता बढ़ाने के लिए, पहले तरल नमूने को निष्फल रूप से निष्फल झिल्ली फिल्टर तंत्र के माध्यम से एक बाँझ झिल्ली फिल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर किया जाता है।
फंसे हुए जीवाणुओं से युक्त झिल्ली फ़िल्टर असमान रूप से एक बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित हो जाता है जिसमें एक चयनात्मक विभेदक तरल माध्यम से अवशोषित एक शोषक पैड होता है। फ़िल्टर की सतह पर मध्यम ऊज। ऊष्मायन के बाद, फिल्टर पर गठित कालोनियों की संख्या को एक सरल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गिना जाता है।
(च) धारावाहिक प्रदूषण-आगर चढ़ाना विधि या टीपीसी विधि:
यह बैक्टीरिया की गणना के लिए सबसे बहुमुखी और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है।